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PCR digitale (dPCR) en émulsion

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Last Updated on Monday, 28 May 2018 14:46 Written by Administrator Monday, 28 May 2018 14:40

Nous sommes heureux de vous informer que la plateforme vient de se doter d'un système de PCR digitale en émulsion sur puces microfluidiques. Il s'agit du système Naica fabriqué par la société Stilla Technologies (https://www.stillatechnologies.com). L’instrument sera disponible sur la plateforme à partir du 11 juin 2018, et son utilisation sera ouverte à toutes et tous, régie par les règles en vigueur sur la plateforme.

Pour celles et ceux qui veulent en savoir plus, voici quelques informations supplémentaires :

Complémentaire à la qPCR, la dPCR permet de dépasser les limites de cette dernière, à savoir : quantification absolue impossible si l’on ne possède pas d’acide nucléique de référence, détection de SNP difficile en cas de déséquilibre allélique < 5 %, résolution de CNV limitée à 2 copies contre 3 copies, sensibilité aux inhibiteurs contenus dans les échantillons environnementaux. Voici quelques exemples d’applications :

· Quantification absolue [1,2,3], en particulier sur des échantillons environnementaux contenant de très faibles quantités d’acides nucléiques et pour lesquels on ne dispose pas d’ADN ou d’ARN de référence.

· Préparation de banques NGS [1,7] : la dPCR permet de quantifier de façon fiable les banques destinées au séquençage haut débit, voire même de contrôler la taille des fragments contenus dans ces banques, permettant ainsi d’optimiser la procédure de préparation.

· Génotypage [4,5]:

o Détection d’allèles rares / individus rares : le partitionnement de l’échantillon en réacteurs de quelques nanolitres permet d’isoler des molécules uniques et de les amplifier sans compétition, permettant ainsi la détection d’individus ou d’allèles rares (1/20000) dans une population et de les faire ainsi ‘sortir du bruit de fond’. Ceci permet d’atteindre une sensibilité inégalable en e-barcoding ou dans la détection des mutations somatiques.

o Résolution des CNV [6]: en qPCR classique, pour distinguer la présence de 4 copies versus 5 copies, il faut 456 réplications du même échantillon ; en dPCR, l’échantillon fractionné en 20k partitions résout plus facilement le même CNV.

Références:

1) White RA et al (2009). Digital PCR provides sensitive and absolute calibration for high throughput sequencing. BMC Genomics 10:116.

2) Tadmor AD (2011). Probing individual environmental bacteria for viruses by using microfluidic digital PCR. Science 333: 58 – 62.

3) Majumdar N et al (2015). Digital PCR Modeling for Maximal Sensitivity, Dynamic Range and Measurement Precision. PloSONE 10(3): e0118833.

4) Deniz Pekin et al (2011). Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics. Lab Chip 11, 2156

5) Coren A. Milbury et al (2014). Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular Detection and Quantification 1:8–22.

6) Suzanne Weaver et al (2010). Taking qPCR to a higher level: Analysis of CNV reveals the power of high throughput qPCR to enhance quantitative resolution. Methods 50: 271–276.

7) Dirk S Paul et al (2014). Assessment of RainDrop BS-seq as a method for large-scale, targeted bisulfite sequencing. Epigenetics 9:5, 678–684.

Pour plus d'informations, voir aussi : http://digital-pcr.gene-quantification.info/.

 

Tarification, Fournitures

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Last Updated on Friday, 29 June 2012 12:44 Written by Administrator Friday, 16 July 2010 09:02

Voici quelques infos pratiques :

- Le temps machine est facturé, sur la base de l'utilisation réelle.

- La plateforme met à disposition des utilisateurs tous réactifs et consommables nécessaires à la réalisation des manips courantes :

  • Roche LC 480 : plaques 384, opercules, mix SybrGreen
  • Roche LC Capillaires : capilllaires et mix SyBrGreen
  • Roche LC Nano : tubes PCR et Mix SyBrGreen
  • Agilent Bioanalyzer : Kit RNA 6000 Nano : puces et réactifs, ladder.
  • Robot Perkin Elmer Janus : boites de cônes non conductifs et conductifs.

NB : L'usage des fournitures plateforme est totalement facultatif.

- La tarification appliquée au temps machine et aux fournitures est calculée de façon à permettre à la plateforme de financer leur avance et les contrats d'entretien des instruments qui le nécessitent. Le volume important de nos achats nous fait obtenir des avantages significatifs auprès de nos fournisseurs. Cela nous permet de dégager une marge mais de proposer néanmoins les fournitures à un prix avantageux à nos utilisateurs, tout en leur évitant l'achat de kits complets.

Voici la tarification 2007 :

Voici la tarification 2010 :

 

 

Conditions d'accès à la plateforme

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Last Updated on Friday, 29 June 2012 13:08 Written by Administrator Thursday, 15 July 2010 10:37

- La plateforme est ouverte aux chercheurs et étudiants de toutes institutions publiques ou privées.

  • en 2012 plus de 80 usagers en provenence de 45 équipes différentes d'origine EPST EPIC et privés

- L'utilisation des instruments ne peut se faire que sur réservation, il est nécessaire pour cela d'être inscrit sur le site de réservation

- Le responsable de la plateforme est à la disposition des utilisateurs pour :

  • La conception des manips : amorces d'amplification, sondes, optimisation validation, gammes...
  • Formation aux logiciels de pilotage
  • L'analyse des données
  • La mise en place de protocoles robotiques de pipetage
   

Message important pour tous les utilisateurs de la plateforme qPCR

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Last Updated on Friday, 29 June 2012 13:06 Written by Administrator Thursday, 15 July 2010 09:13

Messages importants pour tous les utilisateurs de la plateforme qPCR

 

  • Depuis le 15 Novembre 2010 le nouveau site de réservation que j'ai mis en place permet de réserver tous les instruments de la plateforme.

L'adresse du site :

http://www.pbs.univ-montp2.fr/resa

Attention pour pouvoir réserver sur ce nouveau site, il est nécessaire d'être inscrit et de se loger sur votre compte. Pour vous inscrire, veuillez remplir la fiche et me le retourner sans délai afin que tout soit prêt le jour dit

L'adresse de la fiche :

http://www.pbs.univ-montp2.fr/telechargement/qPHD_fiche_inscription.rtf

 

  • Depuis le 01 Mai 2012, les saisies de consommations se font sur un logiciel maison "Ma Conso". Le poste de saisie se trouve dans mon bureau. Utilisez vos identifiants et mots de masses du site de réservation pour autentifier vos transactions.